• Inleiding
• Nieuwe aanpak voor behandeling met exon skipping
• In vitro en in vivo haalbaarheidsonderzoek voor exon skipping bij de exons 73 en 80 van het gen COL7A1
• Toekomst: klinische toepassing op grotere schaal van deze niet-invasieve behandeling
• Info en contact

Inleiding

Recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB) wordt veroorzaakt door mutaties in het gen COL7A1 dat voor collageen VII codeert. Patiënten hebben van bij hun geboorte te kampen met huid en slijmvliezen die loslaten waardoor er blaren ontstaan. Vaak gaat het om ernstige en grote wonden.  Collageen VII komt samen in ankervezels, essentiële structuren voor de hechting van de huidlagen. Er bestaat geen specifieke behandeling, maar er worden momenteel verschillende gen- en celtherapieën bestudeerd.

Genetische informatie is gesegmenteerd: de coderende onderdelen (exons) worden onderbroken door niet-coderende sequenties (introns). Bij de splicing worden de introns (niet-coderende sequenties) verwijderd. Nadien worden de resterende exons gebruikt voor de proteïnesynthese. Exon skipping heeft tot doel om bij de splicing een welbepaalde exon te verwijderen die een mutatie in zich draagt, zodat de synthese van een iets kortere maar werkende proteïne mogelijk wordt. 

Nieuwe aanpak voor behandeling met exon skipping

Onze therapie met exon skipping is gebaseerd op de mogelijkheid van kleine anti-sense moleculen (oligonucleotides) om de splicing in de celkernen te “misleiden” en zo ervoor te zorgen dat de exon(s) die een mutatie draagt/dragen van het gen COL7A1 “geskipt” worden.  Er bestaan 118 exons van COL7A1. De exons 73, 74 en 80 zijn voor ons het interessantst aangezien ze heel wat recessieve of dominante mutaties in zich dragen (Afbeelding 1).

Afb.1: het COL7A1-gen leent zich perfect tot exon skipping.

De verschillende exons van gen COL7A1 zijn hier afgebeeld in de kleur die overeenstemt met de proteïsche domeinen die eronder staan afgebeeld. COL7A1 is opgebouwd uit 118 kleine exons (tussen de 27 en 350 bp) en alle exons die het centraal collageen domein coderen (exons 29 tot 112 in het blauw) bevinden zich in hetzelfde open leesraam. De exons 73, 74 en 80 (in het rood) vertonen het vaakst een mutatie en werden dus uitgekozen. 

In vitro en in vivo haalbaarheidsonderzoek voor exon skipping bij de exons 73 en 80 van het gen COL7A1

We hebben allereerst in vivo aangetoond dat menselijk collageen VII zonder sequenties die gecodeerd zijn door deze exons ook functioneel zijn in een transplantaatmodel van RDEB-huid die gereconstrueerd werd op muizen. Vervolgens hebben we anti-sense moleculen (AON’s) ontwikkeld die in staat zijn om op een doeltreffende manier (50 à 95 %) de exon skipping teweeg te brengen bij de exons 73, 74 en 80, in de keratinocyten en fibroblasten van RDEB-patiënten met een significante heroverdracht van collageen VII (20 à 30 %). Tot slot hebben we de AON’s in vivo geïnjecteerd in de gereconstrueerde huid die we verkregen op basis van cellen van RDEB-patiënten die nulmutaties droegen in de exons 73 en 80, en hebben we die huid getransplanteerd op muizen. We zijn erin geslaagd om een significante heroverdracht van collageen VII aan te tonen bij de dermo-epidermale junctie evenals de aanwezigheid van ankervezels (Afbeelding 2).

A) Experimentele procedure: keratinocyten en fibroblasten van RDEB-patiënten die mutaties dragen in exon 73 of 80 werden gebruikt om huidequivalenten te produceren die op hun beurt werden getransplanteerd op immunodeficiënte muizen. Vervolgens werden de anti-sense oligonucleotiden (AON's) onderhuids geïnjecteerd (1 of 2 injecties met een week tussentijd). Twee maanden later werd ter analyse een monster genomen van de transplantaten. 

B) In vivo herstel van de C7-overdracht en vorming van ankervezels na de exon skipping van 73 (a) of 80 (b). De analyses met immunohisto-fluorescentie (IHF) tonen aan dat C7 (in het rood) wordt herovergedragen na 1 of 2 injecties van AON’s en bij een elektronenmicroscopie (TEM) is de vorming van ankervezels zichtbaar (rode pijltjes). De histogrammen rechts geven het aantal ankervezels op een afstand van 10 µM weer. Controle: huidequivalent uit cellen van gezonde proefpersonen. De rode lijn geeft de minimumwaarde aan van de ankervezels per 10 µM in de normale menselijke huid. OB, onbehandeld; 1X, 1 injectie; 2X, 2 injecties. Schalen: 50 µM voor de IHF en 200 nM voor de TEM. Statistiek: Student t-toets (*P<0.0, **P<0.01, ***P<0.001).

Toekomst: klinische toepassing op grotere schaal van deze niet-invasieve behandeling

Deze aanpak maakt niet-invasieve lokale en/of systemische behandelingen mogelijk voor de verzorging van huid- en slijmvlieswonden, meer bepaald orale letsels en letsels in de slokdarm. Dankzij de ongecompliceerde productie voor klinische doeleinden en de eenvoudige toediening van de anti-sense moleculen (AON's), kan deze aanpak gemakkelijk klinisch worden uitgebouwd. Ongeveer 12 % van de RDEB-patiënten draagt mutaties in de exons 73, 74 en 80, maar men kan zich ook richten op veel andere exons van COL7A1. Zo zouden nog meer patiënten kunnen genieten van deze nieuwe, niet-invasieve behandeling.

Info en contact

Matthias Titeux

Onderzoeker in het team van prof. Alain Hovnanian: ‘Maladies génétiques cutanées : des approches physiopathologiques aux traitements’, INSERM UMR1163.

Institut Imagine, 24 bld du Montparnasse, 75015 Parijs

Tel.: 01 42 75 42 81

[email protected]

Lees het artikel in Journal of Investigative Dermatology, december 2016:  Targeted Exon Skipping Restores Type VII Collagen Expression and Anchoring Fibril Formation in an In Vivo RDEB Model