Thérapie par saut d’exon pour les EBDR

Introduction
Une nouvelle approche de thérapie par saut d'exon
Preuve de faisabilité in vitro et in vivo du saut des exons 73 et 80 de COL7A1
Le futur : développement clinique de cette approche non invasive
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Introduction

Les épidermolyses bulleuses dystrophiques récessives (EBDR) sont dues à des mutations du gène COL7A1 codant le collagène VII. Les patients souffrent dès la naissance de décollements bulleux cutanés et muqueux souvent étendues et sévères. Le collagène VII s’assemble en fibres d’ancrage qui sont des structures essentielles pour l’adhésion dermo-épidermique. Il n’existe pas de traitement spécifique, mais différentes approches de thérapie génique et cellulaires sont à l’étude.

Dans les gènes, l’information génétique est segmentée : les parties codantes (les exons) sont interrompues par des séquences non codantes, les introns. Lors du processus d’épissage, les introns (séquences non codantes) sont éliminés et seuls restent les exons dont l’information sera utilisée pour synthétiser les protéines. La stratégie du saut d’exon vise à exciser spécifiquement un exon porteur d’une mutation durant le processus d’épissage pour permettre la synthèse d’une protéine légèrement plus courte mais fonctionnelle.

Une nouvelle approche de thérapie par saut d'exon

Notre approche de thérapie par saut d’exon est basée sur la capacité de petites molécules antisens (oligonucléotides) à leurrer la machinerie d’épissage dans le noyau des cellules pour induire le saut du ou des exons ciblés porteurs de mutations de COL7A1. Parmi les 118 exons de COL7A1, les exons 73, 74 et 80 sont particulièrement intéressants car ils portent un grand nombre de mutations récessives ou dominantes.

Les différents exons du gène COL7A1 sont représentés avec la couleur correspondant aux domaines protéiques représentés en dessous. Le gène COL7A1 est constitué de 118 petits exons (27 à 350 pb) et tous les exons codant le domaine collagène central (exons 29 à 112, en bleu) sont dans la même phase de lecture ouverte. Parmi ceux-ci, les exons 73, 74 et 80 (colorés en rouge) sont les plus fréquemment mutés et ont été choisis.

Preuve de faisabilité in vitro et in vivo du saut des exons 73 et 80 de COL7A1

Nous avons d’abord démontré in vivo que le collagène VII humain dépourvu des séquences codées par ces exons est fonctionnel dans un modèle de greffe de peau EBDR reconstruite sur des souris. Puis nous avons conçu des molécules antisens (AONs) capables d’induire le saut des exons 73, 74 et 80 avec une grande efficacité (50% à 95%) dans des kératinocytes et des fibroblastes de patients EBDR avec une réexpression significative de collagène VII (20%-30%). Enfin, nous avons injecté in vivo les AONs dans des peaux reconstruites produites avec des cellules de patients EBDR porteurs de mutations nulles dans les exons 73 et 80 et nous les avons greffées sur des souris. Nous avons pu démontrer une réexpression significative de collagène VII à la jonction dermo-épidermique et la présence de fibre d’ancrage.

A) Procédure expérimentale : des kératinocytes et des fibroblastes de patients EBDR porteurs de mutations dans les exons 73 ou 80 ont été utilisés pour produire des peaux équivalentes qui ont été greffées sur des souris immunodéficientes. Les oligonucléotides antisens (AON) ont ensuite été injectés en sous cutané (1 ou 2 injections à 1 semaine d’intervalle). Les greffons ont été prélevés pour analyses 2 mois après.

B) Restauration de l’expression de C7 et formation de fibres d’ancrage in vivo après saut de l’exon 73 (a) ou 80 (b). Les analyses en immunohistofluorescence (IHF) démontrent la réexpression de C7 (en rouge) après 1 ou 2 injections d’AON et la formation de fibres d’ancrage (têtes de flèche rouges) visibles en microscopie électronique (TEM). Les histogrammes à droite représentent le comptage des fibres d’ancrage sur une distance de 10 µM. Témoin : peau équivalente constituée de cellules de sujets sains. La barre rouge indique la valeur minimale de fibre d’ancrage par 10 µM dans une peau humaine normale. NT, non traité ; 1X, 1 injection ; 2X, 2 injections. Echelles : 50 µM pour l’IHF et 200 nM pour la TEM. Statistique : Test t de Student (*P<0.0, **P<0.01, ***P<0.001).

Le futur : développement clinique de cette approche non invasive

Cette approche ouvre la possibilité de traitements locaux et/ou systémiques non invasifs qui pourraient traiter les plaies cutanées et muqueuses, en particulier oesophagiennes et orales. La facilité de production en qualité clinique et d’administration des molécules antisens (AON) facilitera le développement clinique de cette approche. Environ 12% des patients EBDR présentent des mutations dans les exons 73, 74 ou 80, mais un grand nombre d’autres exons de COL7A1 peuvent également être ciblés ce qui devrait augmenter la proportion de patient qui pourraient bénéficier de cette nouvelle approche non invasive.